Einblick in die Forschungsförderung der DGM 2017/2018

In ihrem Abschlussbericht erläutert Prof. Dr. rer. nat. Olivia Merkel von der  Ludwig-Maximilians-Universität in München das von der DGM geförderte Forschungsprojekt zu Behandlung der Myotonen Dystrophie mit Zuckern und CRIPSR-molekularer Schere.

Myotone Dystrophie Typ 1 (DM1) ist die am häufigsten auftretende Muskeldystrophie bei Erwachsenen, mit einer sehr hohen Prävalenz, die auf 1 von 8000 Erwachsenen geschätzt wird. Es handelt sich dabei um eine erbliche, multiple systemische neuromuskuläre Trinukleotid-Repeat-Erkrankung. Die Krankheit wird durch eine 3'-CTG-Repeat-Expansion im Dystrophia-Myotonica-Protein-Kinase (DMPK)-Gen verursacht, die zur Bildung von "toxischer RNA" führt. Da DM1 hauptsächlich durch toxische RNA vermittelt wird, haben sich kleine Inhibitoren, die auf das DMPK-Protein abzielen, als unwirksam für die DM1-Behandlung erwiesen. Derzeit gibt es kein Heilmittel für DM1. Behandlungen konzentrieren sich auf die Bekämpfung von Symptomen und Physiotherapie. In diesem Projekt entwickelten wir eine CRISPR-Cas9-basierte Deletion der Trinukleotid-Repeat-Expansion. Mit diesem innovativen Verfahren wurde eine gezielte Abgabe des Genom-Editierungs-Komplexes mittels zellulärer Mannose und Mannose-6-Phosphat-Rezeptor-vermittelter Endozytose unter Verwendung von Nanoformulierungen der Plasmid-DNA erreicht.

Genschere, molekulares Skalpell – solche und andere Umschreibungen aus der Alltagssprache sollen ausdrücken, was die neue Methode mit dem Namen CRISPR/Cas9 kann: schneiden – genauer gesagt das Erbgutmolekül DNA durchtrennen und zwar präzise an einer bestimmten Stelle. Forscher können so Gene ausschalten oder an der Schnittstelle neue Abschnitte einfügen. Daher können mit CRISPR/Cas9 defekte Gensegmente durch Editieren von Genen entfernt und die entsprechenden Krankheitsbilder behandelt werden, beispielsweise für Duchenne-Muskeldystrophie, Tyrosinämie oder Lebersche kongenitale Amaurose. Wir haben uns dazu entschlossen, die Trinukleotid-Repeat-Expansion in DMPK mit CRISPR/Cas9 zu löschen. Dafür konstruierten wir zwei guide-RNAs (sgRNAs), die die genomische DNA spezifisch vor und nach dem Trinukleotid-Repeat schneiden (Abbildung 1A). Die guide-RNAs wurden zusammen mit dem grün fluoreszierenden Protein, GFP, in ein Plasmid, das das Cas9-Protein exprimiert, kloniert (Abbildung 1B). Das GFP-Protein zeigt an, wie viele Zellen die Plasmid-DNA nach der Transfektion aufgenommen haben.

guide-RNAs

Abbildung 1: Konstruieren und Klonierung der beiden Guide-RNAs. (A)
Die zwei sgRNAs (rosa Dreieck) die vor und nach dem Trinukleotid-Repeat (schwarzes Rechteck) schneiden. (B) Plasmid mit Cas9 protein und GFP wo die sgRNAs kloniert sind.

Bevor CRISPR-Cas9 bei Patienten eingesetzt werden kann, gibt es jedoch noch eine große Hürde zu überwinden: Wie gelangt die Genschere an ihren Wirkort? Dafür brauchen wir ein Vehikel, das CRISPR-Cas9 direkt ins Zellinnere schleust. Eine Möglichkeit dafür wäre, stabile und zielgerichtete Nanocarrier-Formulierungen zu verwenden. Ein Ansatz ist es, bestimmte Zucker-Rezeptoren, die auf Muskelzellen exprimiert werden, anzusteuern. Beispiele hierfür sind der Mannose- und der Mannose-6-Phosphat-Rezeptor. Jede menschliche Körperzelle hat ein Zelltyp-spezifisches Repertoire an Oberflächen-Rezeptoren, um die Aufnahme aller nötigen Nährstoffe zu gewährleisten. Aufgrund ihres hohen Energiebedarfs haben Muskelzellen eine höhere Affinität für Kohlenhydrate, und exprimieren zum Beispiel vermehrt Mannose- und Mannose-6-Phosphat-Rezeptoren (Abbildung 2), um die effiziente Endozytose dieser Zucker für die intrazelluläre Energieproduktion zu gewährleisten. Am Besten lässt sich dieser Ansatz mit dem „Schlüssel-Schloss-Prinzip“ erklären: Der Mannose- bzw. Mannose-6-Phosphat-Rezeptor auf der Zelloberfläche repräsentiert das Schloss und der Mannose-Ligand auf dem Nanocarrier den dazu passenden Schlüssel. Nach der Bindung an den Rezeptor wird der komplette Komplex endozytiert. Diese Form der Aufnahme in die Zielzelle kann man sich folgendermaßen vorstellen: Aus dem Zellmembran bildet sich eine nach Innen ins Zytosol gerichtete Abschnürung, die auch den Komplex mit einschließt.

Patientenmuskelzellen

Abbildung 2: Hohe Expression des Mannose-6-Phosphat-Rezeptors in Patientenmuskelzellen.

In unseren Experimenten konnten wir einen signifikanten Anstieg der Aufnahme von mannosylierten Nanocarriern in Muskelzellen im Vergleich zu nicht-modifizierten Partikeln zeigen (Abbildung 3A). Folglich transfizierten wir die Plasmid-DNA mit Hilfe der Nanocarrier und maßen ihre Aufnahme über die Expression von GFP. Wir bemerkten signifikante GFP-Expression bereits bei niedrigen Konzentrationen des Plasmids (Abbildung 3B), was vermuten lässt, dass unser System gut geeignet ist, um funktionelle Plasmid-DNA in Muskelzellen zu transportieren.

Vergleich Muskelzellen

Abbildung 3, A u. B: Der Anstieg der Aufnahme von mannosylierten Nanocarriern in Muskelzellen im Vergleich zu nicht-modifizierten Partikeln.

Wir arbeiten derzeit daran, das therapeutische Potenzial unseres Genome Editierung Systems in erkrankten Muskelzellen und Mausmodellen aufzuzeigen.