Gegenwärter Stand der Gentherapieforschung bei der progressiven Muskeldystrophie vom Typ Duchenne

Hanns Lochmüller und George Karpati

Gene Therapy Team of the Neuromuscular Research Group, Montreal Neurological Institute, McGill University, 3801 Rue University, Montreal, Quebec, Canada H3A2B4

Zusammenfassung

In den letzten Jahren sind im Rahmen der präklinischen Forschung große Fortschritte auf dem Weg zu einer somatischen Gentherapie bei der progressiven Muskeldystrophie vom Typ Duchenne gemacht worden. Replikationsdefekte adenovirale Vektoren wurden entwickelt, mit denen ein Minidystrophin-Gen erfolgreich in die Muskulatur von dystrophischen Mäusen (mdx) übertragen werden kann. Langdauernde Dystrophin-Expression kann erzielt werden, wenn der Gentransfer in sehr junge oder immunsupprimierte Tiere erfolgt. Andernfalls zerstört eine gegen den Vektor gerichtete Abwehrreaktion des Wirtsimmunsystems die transduzierten Muskelfasern.

Dieses Problem und andere offene Fragen müssen gelöst werden, bevor erste klinische Studien zur Gentherapie bei der progressiven Muskeldystrophie vom Typ Duchenne in Angriff genommen werden können.

Einleitung

Seit Mitte der achziger Jahre werden weltweit große Anstrengungen unternommen, neue Therapieformen zur Behandlung der progressiven Muskeldystrophie vom Typ Duchenne zu entwickeln. Ausschlaggebend dafür waren die relative Häufigkeit und der Schweregrad der Erkrankung sowie das Fehlen therapeutischer Alternativen. Die Transplantation von Myoblasten zeigte anfänglich vielversprechende Ergebnisse im Tiermodell, führte jedoch nicht zum erhofften therapeutischen Erfolg in klinischen Versuchen. Es konnte gezeigt werden, daß die Gabe von Corticosteroiden zu einer funktionellen Verbesserung verhilft, jedoch muß auf Nebenwirkungen der Medikation geachtet werden.

Ein neuer attraktiver Ansatz zur kausalen Behandlung der progressiven Muskeldystrophie vom Typ Duchenne, die somatische Gentherapie, soll in diesem Beitrag diskutiert werden:

Somatische Gentherapie bedeutet, daß Gene mit Hilfe eines Vektorsystems in Zellen des Körpers eines Patienten eingebracht werden, um die Symptome einer Erkrankung zu lindern oder den Patienten zu heilen. Als ethisch nicht vertretbar – und daher im weiteren nicht diskutiert – gilt ein Gentransfer in Zellen der Keimbahn, durch den die genetische Ausstattung künftiger Generationen verändert werden könnte.

Folgende Voraussetzungen müssen zur Entwicklung eines gentherapeutischen Ansatzes einer hereditären Erkrankung erfüllt sein und bestehen im Fall der Muskeldystrophie Duchenne:

Im Folgenden werden wir zunächst die Instrumente des Gentransfers, d.h. die therapeutischen Gene und Vektoren, sowie präklinische Ergebnisse des Gentransfers im Tiermodell diskutieren.

Des Weiteren wollen wir einen Ausblick darauf geben, welche offenen Fragen und Probleme des Gentransfers gelöst werden müssen, bevor erste klinische Studien zur somatischen Gentherapie bei der progressiven Muskeldystrophie vom Typ Duchenne begonnen werden können.

Therapeutische Gene und Vektoren

In den letzten Jahren konnte gezeigt werden, daß verschiedene Vektoren zum Gentransfer in eukaryontische Zellen in vitro und in vivo geeignet sind, wenn auch mit unterschiedlicher Effizienz. Für den Skelettmuskel wurden u.a. folgende Vektorsysteme getestet:

Am effizientesten im Falle des Skelettmuskels erwies sich ein System, bei dem das therapeutische Gen mit Hilfe eines replikationsdefekten Adenovirus übertragen wird [1]. Erste klinische Studien mit diesem System wurden bereits in der Therapie von Mukoviszidose und von Malignomen begonnen [2–4].

Folgende weitere Charakteristika rekombinanter Adenovirusvektoren sprechen für ihre Verwendung als Instrument zum somatischen Gentransfer:

Methoden wurden entwickelt, um replikationsdefekte Adenovirusvektoren relativ einfach und kostengünstig zu erzeugen, aufzureinigen und zu hochtitrigen Suspensionen zu konzentrieren [5].

Der derzeitige Wissensstand beruht weitgehend auf Adenovirusvektoren der ersten Generation. Adenovirusvektoren der ersten Generation haben Deletionen in den Genregionen E1 und E3 (early region 1 and 3), Vektoren neuerer Generationen weisen zusätzliche Deletionen oder Modifikationen auf. Folgende Probleme des Vektorsystems konnten identifiziert werden:

Die Expression des Minidystrophin-Gens wird in diesen Vektoren in der Regel durch starke virale Promoteren angetrieben. Das bedeutet zum einen, daß Dystrophin unter Umständen über das natürliche Maß hinaus exprimiert wird, und zum anderen, daß Dystrophin auch in anderen Zellen und Geweben als dem Skelettmuskel exprimiert wird, falls diese Gewebe durch den Vektor infiziert werden. Bisher sind jedoch noch keine negativen Effekte dieser Phänomene beobachtet worden. In Zukunft soll gewebespezifische Expression dadurch erreicht werden, daß das Dystrophin-Gen unter die Kontrolle eines muskelspezifischen Promoters gestellt wird.

Dystrophin-Gentransfer im Tiermodell

Im Laufe der letzten beiden Jahre ist es am Tiermodell (mdx Maus) gelungen, die Bedingungen für den Gentransfer in vivo zu optimieren, Aspekte zur biologischen Sicherheit des Gentransfers aufzuzeigen sowie die funktionellen und immunologischen Auswirkungen des Gentransfers zu untersuchen.

Abb. 1
Abb. 1

Adenovirus vermittelter Gentransfer in den Skelettmuskel einer mdx-Maus ohne Immunsuppression

15 ul eines Dystrophin-Minigen exprimierenden Adenovirusvektors wurden in den Musculus tibialis anterior einer sechs Wochen alten mdx-Maus injiziert. Zehn Tage später wurde der Muskel entnommen, Querschnitte angefertigt (6 um Dicke) und mit Antikörpern gegen Dystrophin (Peroxidase) sowie Hämatoxilin-Eosin angefärbt.

Ein hoher Anteil von Muskelfasern ist Dystrophin-positiv (kurzer Pfeil), nur wenige sind Dystrophin-negativ (langer Pfeil). Außerdem ist eine starke entzündliche Reaktion, bestehend aus mononukleären Zellen, sichtbar (schwarzer Stern). Mehrere Dystrophin-positive Muskelfasern werden durch mononukleäre Zellen infiltriert (weißer Stern).

Abb. 2
Abb. 2

Immunsuppression mit FK 506 (Tacrolimus)

15 ul eines Dystrophin-Minigen exprimierenden Adenovirusvektors wurden in den Musculus tibialis anterior einer sechs Wochen alten mdx-Maus injiziert. Während der Dauer des Versuchs wurde das Tier durch tägliche subkutane Injektion von FK 506 immunsupprimiert. 60 Tage später wurde der Muskel entnommen, Querschnitte angefertigt (6 um Dicke) und mit Antikörpern gegen Dystrophin (Peroxidase) angefärbt. Ein hoher Anteil von Muskelfasern ist Dystrophin-positiv (kurzer Pfeil), nur wenige sind Dystrophin-negativ (langer Pfeil). Zahlreiche Muskelfasern zeigen neben der "regulären" subsarkolemmalen Färbung eine zytoplasmatische Färbung mit Dystrophin-Antikörpern (Stern). Dies ist wahrscheinlich auf eine sog. "Überexpression" des Dystrophin-Minigens zurückzuführen.

Die Voraussetzungen für den Gentransfer in Muskelzellen mit Hilfe des Adenovirussystems wurden in vitro und in vivo untersucht [10, 11]. Dabei zeigte sich, daß das Minidystrophin-Gen mit Hilfe von adenoviralen Vektoren in einen hohen Prozentsatz von Muskelfasern übertragen werden konnte, insbesondere wenn viele unreife Muskelfasern zum Zeitpunkt des Gentransfers im Muskel nachzuweisen waren. Diese Voraussetzung besteht bei sehr jungen Tieren oder bei mdx-Mäusen generell [13]. Nach intraarteriellen Injektionen des Vektors konnte ein Gentransfer auch in die Herz- und Atemmuskulatur nachgewiesen werden [14].

Im letzten Jahr wurden in erster Linie die funktionellen und immunologischen Auswirkungen des Gentransfers in die Skelettmuskulatur mit Hilfe rekombinanter Adenoviren untersucht. Wenn der Dystrophin-Gentransfer in neugeborenen mdx-Mäusen, deren Immunsystem noch nicht voll funktionsfähig ist, durchgeführt wurde, konnten langdauernde Expression und positive funktionelle Effekte des Transgens nachgewiesen werden [11,15].

Im erwachsenen, immunkompetenten Tier jedoch zeigte der Gentransfer mit Hilfe rekombinanter Adenoviren zunächst negative funktionelle Effekte, d.h. ein Nachlassen der Muskelkraft, die sich teilweise mit der Toxizität bestimmter Vektorbestandteile, größtenteils jedoch auf eine Abwehrreaktion des Wirtsorganismus zurückführen lassen [11, 16]. In der Zerstörung transduzierter Muskelfasern spielen zytotoxische T-Lymphozyten (CD8+) eine instrumentelle Rolle (Abb.1). Außerdem konnte nachgewiesen werden, daß durch die Vektorapplikation eine humorale Abwehrreaktion mit Antikörperproduktion gegen den Vektor und gegen Dystrophin erzeugt wird [17]. Antikörper gegen Vektorbestandteile verhindern möglicherweise den Erfolg einer wiederholten Injektion des Vektors.

Abb. 3
Abb. 3

Adenovirus vermittelter Gentransfer in den Skelettmuskel einer mdx-Maus unter Immunsuppression mit FK 506 (Tacrolimus)

15 ul eines Dystrophin-Minigen exprimierenden Adenovirusvektors wurden in den Musculus tibialis anterior einer sechs Wochen alten mdx-Maus injiziert. Während der Dauer des Versuchs wurde das Tier durch tägliche subkutane Injektion von FK 506 immunsupprimiert. 60 Tage später wurde der Muskel entnommen, Querschnitte angefertigt (6 um Dicke) und mit Antikörpern gegen Dystrophin (Peroxidase) sowie Hämatoxilin-Eosin angefärbt.

Ein hoher Anteil von Muskelfasern ist Dystrophin-positiv (kurzer Pfeil), nur wenige sind Dystrophin-negativ (langer Pfeil). Eine entzündliche Reaktion (vgl. Abb. 1) ist nicht sichtbar.

Eine Möglichkeit, diese Abstoßungsreaktion zu verhindern, bietet die immunsuppressive Behandlung mit Medikamenten, wie sie auch in der Transplantationsmedizin verwendet werden. Durch die Gabe von FK506 (Tacrolimus) beispielsweise konnte eine deutlich länger anhaltende Dystrophin-Expression im ansonsten immunkompetenten Tier erzielt werden (Abb. 2 und 3). Möglicherweise kann diese immunsuppressive Behandlung auf einen relativ kurzen Zeitraum während und nach dem Gentransfer begrenzt werden [17–19]. Voraussetzung dafür ist jedoch, daß das Transgenprodukt, Dystrophin, selbst nicht maßgeblichen Anteil an der Entstehung dieser Abwehrreaktion hat, was Gegenstand weiterer Untersuchungen sein wird.

Ausblick – offene Fragen und Probleme

Folgende Fragen und Probleme müssen in den nächsten Jahren gelöst werden, bevor erste klinische Studien zur somatischen Gentherapie bei der progressiven Muskeldystrophie vom Typ Duchenne in Angriff genommen werden können:

Die durch adenovirale Vektoren ausgelöste Immunreaktion stellt derzeit noch ein Hindernis für einen langanhaltenden therapeutischen Erfolg dar. Immunsuppressive Behandlung und die Entwicklung weniger immunogener Vektoren lassen dieses Problem lösbar erscheinen.

Die funktionellen und klinischen Auswirkungen des Dystrophin-Gentransfers müssen noch weiter untersucht werden. Dazu eignet sich insbesondere das Modell des dystrophischen xmd-Hundes, der besser als die mdx-Maus die Pathophysiologie und den klinischen Verlauf der menschlichen Erkrankung widerspiegelt. Erste Versuche dazu wurden bereits begonnen.

Eine weitere offene Frage ist die Dissemination des Vektors. Direkte intramuskuläre Injektion des Vektors erscheint nicht praktikabel, insbesondere für die schwer zugängliche Atem- und Atemhilfsmuskulatur wie das Zwerchfell. Daher werden derzeit systemische Wege der Vektorapplikation intensiv untersucht.

Sicherheitsfragen müssen geklärt werden. Jedoch erscheint Gentherapie mit adenoviralen Vektoren als relativ risikoarm, da selbst replikationsfähige Adenoviren in der Regel nur harmlose Atemwegsinfekte hervorrufen, bereits als Impfstoff verwendet wurden und nie mit menschlichen Tumorerkrankungen in Verbindung gebracht werden konnten.

Ethische und ökonomische Überlegungen müssen angestrengt werden. Offene Darstellung der Forschungsergebnisse und Diskussion der möglichen Folgen sollen zu einem gesellschaftlichen Konsens führen, ob diese Therapieform gegenwärtig wünschenswert und finanzierbar ist.

Zusammenfassend gibt der Stand präklinischen Forschung zur Gentherapie bei der progressiven Muskeldystrophie vom Typ Duchenne Anlaß zur Hoffnung, daß diese Therapieform in Zukunft Patienten mit dieser Erkrankung zugute kommen wird.

Danksagung

Unsere Arbeiten, die in diesem Artikel zitiert werden, wurden gefördert durch die Muscular Dystrophy Association (USA), die Muscular Dystrophy Association of Canada und den Medical Research Council of Canada.

Dr. Hanns Lochmüller erhielt ein Postdoktoranden-Stipendium der Deutschen Forschungsgemeinschaft. Wir möchten uns auch bei unseren Kollegen und Mitarbeitern Dr. Basil Petrof, Dr. Giovanna Pari, Ms. Nancy Larochelle, Mr. Vincent Dodelet, Mrs. Qiong Wang, Ms. Carol Allen, Mr. Stephen Prescott, Dr. Bernard Massie und Dr. Josephine Nalbantoglu bedanken, daß sie ihre Forschungsergebnisse für diese Arbeit zur Verfügung gestellt haben.

Literaturangabe

[1]Karpati G, Lochmüller H.
Prospects of gene therapy for genetic skeletal muscle disease.
Transfus Sci 1996; 17:53–61

[2] Boucher R C, Knowles M R.
Gene therapy for cystic fibrosis using E1-deleted adenovirus: A phase I trial in the nasal cavity.
Hum Gene Ther 1994; 5:615–639

[3] Chen S H, Shine H D, Goodman J C, Grossman R G, Woo S L C.
Gene therapy for brain tumors: Regression of experimental gliomas by adenovirus-mediated
gene transfer in vivo.
Proc Natl Acad Sci (USA) 1994; 91:3054–3057

[4]Crystal R G, McElvaney N G, Rosenfeld M A, Chu C S, Mastrangeli A, Hay J G,
Brody S L, Jaffe H A, Eissa N T, DanelC.
Administration of an adenovirus containing the human CFTR cDNA to the respiratory tract of individuals with cystic fibrosis.
Nat Genet 1994; 8:42–51

[5]Berkner K L.
Development of adenovirus vectors for the expression of heterologous genes.
BioTechniques 1988; 6:616–629

[6] Yang Y, Nunes F A, Berencsi K, Furth E E, Gonczol E, Wilson J M.
Cellular immunity to viral antigens limits E1-deleted adenoviruses for gene therapy.
Proc Natl Acad Sci (USA)1994; 91:4407–4411

[7] Bett A, Prevec L, Graham F.
Packaging Capacity and Stability of Human Adenovirus Type 5 Vectors.
J Virol 1993; 63:5911–5921

[8]England S, Nicholson L, Johnson M, Forrest S, Love D, Zubrzyczka-Gaarn E,
Bulman D, Harris J, Davies K.
Very mild muscular dystrophy associated with the deletion of 46% of dystrophin.
Nature 1990; 343:180–182

[9] Cox G A, Cole N M, Matsamura K, Phelps S, Hauschka S D, Campbell K P,
Faulkner J A, Chamberlain J S.
Overexpression of dystrophin in transgenic mdx mice eliminates dystrophic symptoms without toxicity. Nature 1993; 364:725–729

[10]Ragot T, Vincent N, Chafey P, Vigne E, Gilgenkrantz H, Couton D, Cartaud J,
Briand P, Kaplan J, Perricaudet M, Kahn A.
Efficient adenovirus-mediated transfer of a human minidystrophin gene to skeletal muscle of mdx mice. Nature 1993; 361:647–650

[11]Acsadi G, Lochmüller H, Jani A, Huard J, Massie B, Prescott S, Simoneau M, Petrof B, Karpati G. Efficient dystrophin expression in muscles of mdx mice after adenovirus-mediated in vivo gene transfer. Hum Gene Ther 1996; 7:129–140

[12] Kochanek S, Clemens P, Mitani K, Chen H, Chan S, Caskey T.
A new adenoviral vector: Replacement of all viral coding sequences with 28 kb of DNA indepen-dently
expressing full-length dystrophin and b-galactosidase.
Proc Natl Acad Sci (USA) 1996; 93:5731–5736

[13] Acsadi G, Jani A, Huard J, Blaschuk K, Massie B, Holland P, Lochmüller H, Karpati G.
Cultured human myoblasts and myotubes show markedly different transducibility by replication-defective adeno-virus recombinants.
Gene Ther 1994; 1:338–340

[14]Huard J, Lochmüller H, Acsadi G, Jani A, Massie B, Karpati G.
The Route Of Administration Is A Major Determinant Of The Transduction Efficiency
Of Rat Tissues By Adenoviral Recombinants.
Gene Ther 1995; 2:107–115

[15] Vincent N, Ragot T, Gilgenkrantz H, Couton D, Chafey P, Gregoire A,
Briand P, Kaplan J, Kahn A, Perricaudet M.
Long-term correction of mouse dystrophic degeneration by adenovirus-mediated
transfer of a minidystrophin gene.
Nat Genet 1993; 5:130–134

[16] Petrof B, Acsadi G, Jani A, Massie B, Bourdon J, Mastusiewicz N, Yang L, Lochmüller H, Karpati G. Efficiency and functional consequences of adenovirus-mediated in vivo gene transfer to normal and dystrophic (mdx) mouse diaphragm.
Am J Resp Cell Mol Biol 1995, 13:508–517

[17]Lochmüller H, Petrof B J, Pari G, Larochelle N, Dodelet V, Wang Q, Allen C,
Prescott S, Massie B, Nalbantoglu J, Karpati G.
Transient immunosuppression by FK506 permits sustained high level dystrophin expression after adenovirus-mediated dystrophin minigene transfer to skeletal muscles of adult dystrophic [mdx] mice.
Gene Ther 1996; 3: 706–716

[18]Vilquin J, Guerette B, Kinoshita I, RoyB, Goulet M, Gravel C, Roy R., Tremblay J.
FK506 immunosuppression to control the immune reactions triggered by first-
generation adenovirus-mediated gene transfer.
Hum Gene Ther 1995; 6: 1391–1401

[19]Lochmüller H, Petrof B J, Allen C, Prescott S, Massie B, Karpati G.
Immunosuppression by FK506 markedly prolongs expression of adenovirus-delivered transgene in sceletal muscles of adult dystrophic [mdx] mice.
Biochem Biophys Res Com 1995; 213:569–574

DGM · Deutsche Gesellschaft für Muskelkranke e.V.
Im Moos 4
D-79122Freiburg

Anschriften der Verfasser:

Hanns Lochmüller
Friedrich-Baur-Institut bei der Medizinischen
und der Neurologischen Klinik,
Klinikum Innenstadt der Universität München
Ziemssenstraße 1
80336 München

Geroge Karpati
Izaak W. Killiam Chair of Neurology
Montreal Neurological Institute and Hospital
McGill University - 3801 Rue University
Montral - Quebec - Canada


Herausgeber der Schriftenreihe:

Prof. Dr. med. R. Dengler · Hannover
Prof. Dr. med. D. Pongratz · München

Rhone-Poulenc Rorer Logo

Aventis GmbH
ZNS-Service · Ulrich Zipper
Nattermannallee 1 · 50829 Köln
Postfach 350120 · 50792 Köln


Management of Neuromuscular Diseases
Gegenwärtiger Stand der Gentherapieforschung bei der positiven Muskeldystrophie vom Typ Duchenne


Entwurf und Gestaltung
DECON Design Contor GmbH
Frankfurt am Main

© ARCIS Verlag GmbH · München
Druck · Locher GmbH · Köln


ISSN 0949–1503
3. Jahrgang