Dr. Uwe K. Zettl 1 · Dr. Ralf Gold
Neurologische Klinik mit Klinischer
Forschungsgruppe für
Multiple Sklerose
und Neuroimmunologie
Julius-Maximilians-Universität Würzburg
1 gegenwärtige Adresse:
Neurologische Klinik
der Universität Rostock
Zentrale Faktoren für die Entstehung entzündlicher demyelinisierender Zellinfiltrate sowohl im zentralen (ZNS) als auch im peripheren Nervensystem (PNS) sind die Rekrutierung aktivierter, autoimmuner T-Lymphozyten im Immunsystem und deren Fähigkeit, die Blut-Hirn- bzw. Blut-Nerven-Schranke zu überwinden. Das Ausmaß und die Dynamik der entzündlichen Läsionen wird zusätzlich dadurch bestimmt, wie schnell die eingedrungenen T-Lymphozyten das Nervensystem „verlassen". Jüngste Untersuchungen legten die Vermutung nahe, daß hierbei die Apoptose, programmierter Zelltod, ein wesentlicher natürlicher Eliminationsmechanismus sein könnte (8). Im Gegensatz zur Nekrose wird beim Zelltod durch Apoptose eine Freisetzung zellulärer proinflammatorischer Substanzen weitgehend vermieden und eine „schonende" Begrenzung der Entzündungsreaktion ermöglicht (Übersicht in 2).
Wir untersuchten die Frage der Eliminierung autoimmuner T-Lymphozyten im Tiermodell des Guillain-Barré-Strohl Syndroms, der experimentell-autoimmunen Neuritis (EAN) der Lewis-Ratte. Die EAN kann sowohl durch Immunisierung mit Myelinproteinen (aktive EAN) oder durch intravenöse Injektion sensibilisierter T-Lymphozyten (AT-EAN) induziert werden. Da die Pathomechanismen in den beiden EAN Modellen unterschiedlich sind (5), wurden beide Formen der EAN charakterisiert. Zuerst stellten wir uns die Frage nach dem Auftreten von Apoptose während des „natürlichen" Krankheitsverlaufs. Dies wurde kombiniert mit der Untersuchung grundlegender Immunmechanismen der T-Zellaktivierung bei der EAN, so daß in Zusammenschau der Ergebnisse der Ort von Aktivierung und Elimination von Zellen miteinander verglichen werden konnte. Danach untersuchten wir, ob Apoptose in der entzündlichen Läsion pharmakologisch getriggert werden kann, um diesen Mechanismus auch therapeutisch zu nutzen. Gewebe aus Ischiasnerv, Wurzelregion und Spinalganglien sowie die Milz von Lewis-Ratten wurde zu verschiedenen Zeitpunkten der Erkrankung nach transkardialer Perfusionsfixation der Tiere mittels Paraformaldehyd entnommen oder durch Kryokonservierung gelagert. Mittels immunhistochemischer Analyse wurde die Dynamik und die Zusammensetzung der Zellinfiltrate im Nervensystem unter Verwendung der folgenden monoklonalen Antikörper charakterisiert: EDl (Makrophagen), B 115-1 (T-Lymphozyten), W3/13 (Granulozyten und T-Lymphozyten) und R73 (a/b T-Zellrezeptor tragende T-Zellen). Dies wurde mit klinischen Daten (Score für neurologische Ausfälle und Gewichtsverlauf) korreliert. T-Zellaktivierung in der Milz und im Ischiasnerven wurde mittels Einbau von Bromodeoxyuridin (BrdU) in die DNA proliferierender Zellen nachgewiesen (7). BrdU-Einbau in der Milz wurde für das Interstitium sowie die Keimzentren einschließlich periarteriolärer T-Zellregion getrennt ausgewertet. Die Detektion und Quantifizierung erfolgte nach morphologischen Kriterien (8) sowie unter Einsatz molekularbiologischer Techniken in-situ (in-situ Tailing Methode (3)). Zur pharmakologischen Induktion von T-Zellapoptose wurde zu klinisch relevanten Zeitpunkten (Beginn der Symptome und Maximum der Erkrankung) Prednisolon (10mg/kg KG) intravenös verabreicht.
Sowohl die AT-EAN als auch die aktive EAN, ausgelöst durch Immunisierung mit bovinem peripherem Myelin, verliefen typisch (10) und erreichten ihr Maximum am 7. bzw. 17. Tag nach Induktion der Erkrankung. Ein signifikantes Maximum des BrdU-Einbaus in der Milz als einem der Hauptorgane des T-Zellhomings (6) fand sich bei der AT-EAN am 2. Tag, bei der aktiven EAN am 10. Tag nach Induktion der Erkrankung (12) und trat somit in beiden Modellen unmittelbar vor den ersten neurologischen Ausfallssymptomen auf. Nach 2 Wochen (AT-EAN) bzw. 5 Wochen (aktive EAN) ging der BrdU-Einbau in der Milz wieder in den Bereich der Ausgangswerte zurück. Im entzündeten N.ischiadicus trat bei der AT-EAN kaum DNS-Synthese in-situ auf, bei der aktiven Form betraf der BrdU-Einbau überwiegend Zellen mit einer nicht für T-Zellen charakteristischen Morphologie.
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Abbildung 1  Zeitverlauf der T-Zellinfiltration und T-Zellapoptose während der AT-EAN. Dargestellt sind Mittelwert ± SD von 6 Tieren pro Gruppe. |
Abbildung 2  T-Zellinfiltration (links) und T-Zellapoptose (rechts) bei Hochdosis-Steroidtherapie der AT-EAN an Tag 5 bzw. Tag 7. Dargestellt sind Mittelwert ± SD von 6 Tieren pro Gruppe. |
Bei beiden Formen der EAN trat apoptotischer Zelltod bereits in frühen Stadien der Erkrankung auf, erfaßte etwa 10% der infiltrierenden T-Zellen am Krankheitsmaximum und stieg während der Remissionsphase bis auf 25% an (Abbildung 1). Damit lag der relative Anteil an Apoptose deutlich niedriger als bei der experimentell-autoimmunen Enzephalomyelitis (EAE), dem Tiermodell für die Multiple Sklerose beschrieben (8). Trotzdem kann Apoptose als relevanter T-Zelleliminationsmechanismus bei der EAN angesehen werden, da Modelluntersuchungen gezeigt haben, daß eine apoptotische Zelle durchschnittlich nach 4–5 Stunden eliminiert wird (1). Da die histologische Untersuchung nur eine „Momentaufnahme" darstellt, kann man aufgrund der beschriebenen Absolutwerte davon ausgehen, daß ein definiertes Infiltrat im Laufe eines Tages durch Apoptose bis zu 50% verkleinert wird. Weiterhin werfen diese Ergebnisse interessante Fragen auf, wie sich der Unterschied im Ausmaß der Apoptose im ZNS und PNS erklärt. Dies kann durch die gewebeständigen antigenpräsentierenden Zellen mitbeeinflußt werden. Interessanterweise zeigen T-Lymphozyten in späten Stadien nach der Aktivierung von antigenspezifischen T-Zellen durch immunkompetente Schwannzellen charakteristische morphologische Veränderungen für Apoptose, die durch in-situ Tailing bestätigt werden konnten (4).
Analog zu der Situation bei der EAE fand sich auch bei unseren Untersuchungen in der EAN kein relevanter Anteil an Makrophagenapoptose.
Bei vielen entzündlichen Neuropathien des Menschen stellen Glukokortikosteroide eine der Säulen der Therapie dar. Neben den vielfältigen, pleiotropen Wirkungen der Steroidhormone können sie unter verschiedenen Bedingungen T-Zellapoptose induzieren. Deshalb untersuchten wir, ob dieser Wirkmechanismus auch in-situ bei der EAN eine relevante Rolle spielt (11). Sämtliche Experimente wurden an der AT-EAN durchgeführt, weil der homogenere Krankheitsverlauf bei diesem Modell leichtere Aussagen erlaubt. Da möglicherweise eine phasenspezifische Suszeptibilität der infiltrierenden T-Zellen besteht, wurde sowohl die Steroidwirkung in frühen Krankheitsstadien als auch am Maximum der EAN untersucht. Um apoptotische Zellen noch vor der raschen Elimination durch Phagozyten zu erfassen, erfolgte die Perfusion der Tiere 6 Stunden nach der intravenösen Steroidgabe. Analog zu den etablierten Therapieschemen beim Menschen wurden in Pilotexperimenten verschiedene Kombinationen ausgetestet, um möglichst effektiv Apoptose zu induzieren.
Die histologische Analyse ergab einen deutlichen Rückgang der entzündlichen Infiltrate (Abbildung 2), verbunden mit einem Anstieg der Apoptose in-situ im Ischiasnerv. Dies war sowohl bei Therapiebeginn in frühen Krankheitsstadien als auch am Maximum der Erkrankung der Fall. Bei der Auswertung der Makrophageninfiltration ergab sich kein signifikanter Unterschied zu den Kontrollen. Dies steht in Einklang zu den oben bereits genannten Befunden, daß Apoptose von Makrophagen weder bei EAE noch bei EAN eine relevante Rolle spielt.
Therapeutische Bemühungen bei menschlichen Autoimmunerkrankungen haben das Ziel, entweder Rezidive einer Erkrankung zu verhindern oder, wenn der Rückfall schon eingetreten ist, möglichst schnell und schonend die Entzündungsreaktion zu begrenzen. Falls es gelingt, die molekularen Mechanismen des Apoptoseprozesses aufzudecken, bietet sich die Möglichkeit sie krankheitsspezifisch zur Induktion von Apoptose einzusetzen oder die Erkenntnisse zu verwenden, um suszeptible Parenchymzellen wie z.B. Myoblasten im Muskel (9) vor Apoptose zu schützen.
Literatur
1. Bursch W, Paffe S, Putz B, Barthel G, Schulte-Hermann R: Determination of the length of the histological stages of apoptosis in normal liver and in altered hepatic foci of rats. Carcinogenesis 11:847, 1990
2. Cohen JJ, Duke RC, Fadok VA, Sellins KS: Apoptosis and programmed cell death in immunity. Annu Rev Immunol 10:267, 1992
3. Gold R, Schmied M, Giegerich G, Breitschopf H, Hartung HP, Toyka KV, Lassmann H: Differentiation between cellular apoptosis and necrosis by the combined use of in situ tailing and nick translation techniques. Lab Invest 71:219, 1994
4. Gold R, Zielasek J, Kiefer R, Toyka KV, Hartung HP: Secretion of nitrite by Schwann cells and its effect on T-cell activation in vitro. Cell Immunol 168:69, 1996
5. Hartung H-P, Heininger K, Schäfer B, Fierz W, Toyka KV: Immnune mechanisms in inflammatory polyneuropathy. Ann N Y Acad Science 540:122, 1988
6. Klinkert WEF: Homing of antigen-specific T-cells in the Lewis rat. J Immunol 139:1030, 1987
7. Ohmori K, Hong Y, Fujiwara M, Matsumoto Y: In situ demonstration of proliferating cells in the rat central nervous system in experimental autoimmune encephalomyelitis. Lab Invest 66:54, 1992
8. Schmied M, Breitschopf H, Gold R, Zischler H, Rothe G, Wekerle H, Lassmann H: Apoptosis of T lymphocytes in experimental autoimmune encephalomyelitis. Evidence for programmed cell death as a mechanism to control inflammation in the brain. Am J Pathol 143:446, 1993
9. Stangel M, Zettl UK, Mix E, Zielasek J, Toyka KV, Hartung HP, Gold R: H2O2 and nitric oxide-mediated oxidative stress induce apoptosis in rat skeletal muscle myoblasts. J Neuropathol Exp Neurol 55:36, 1996
10. Zettl UK, Gold R, Hartung HP, Toyka KV: Apoptotic cell death of T-lymphocytes in experimental autoimmune neuritis of the Lewis rat. Neurosci Let 176:75, 1994
11. Zettl UK, Gold R, Toyka KV, Hartung HP: Intravenous glucocorticosteroid treatment augments apoptosis of inflammatory T-cells in experimental autoimmune neuritis (EAN) ofthe Lewis rat. J Neuropathol Exp Neurol 54:540, 1995
12. Zettl UK, Gold R, Toyka KV, Hartung HP: In situ Demonstration of T cell Activation and Elimination in the Peripheral Nervous System during Experimental Autoimmune Neuritis in the Lewis rat. Acta Neuropathol (Berl ) 91:360, 1996